收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩定細胞狀態。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養瓶中的培養基，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當的比例進行接種傳代，然后補充新鮮的*培養基至5mL，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中培養；

4) 待細胞*貼壁后，培養觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養基。

產品名稱

名稱    CIK細胞

由于該細胞同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，故又稱為NK細胞（自然殺傷細胞）樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性，和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優點。該細胞對腫瘤細胞的識別能力很強，能精確“點射"腫瘤細胞，但不會傷及“無辜"的正常細胞。尤其對手術后或放化后患者，能消除殘留微小的轉移病灶，防止癌細胞擴散和復發，提高機體免疫力，因此，CIK細胞被認為是新一代的腫瘤過繼細胞免疫方案。

CIK細胞可以通過多機制抗腫瘤、抗病毒：

1.CIK細胞能以不同的機制識別腫瘤細胞，通過直接的細胞質顆粒穿透封閉的腫瘤細胞膜進行胞吐，釋放穿孔素、顆粒酶，實現對腫瘤細胞的裂解；

2.CIK細胞能分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6等多種炎性細胞因子，對腫瘤也有直接抑制作用；

3.CIK細胞可以通過配體-受體（Fas:FasL）介導的方式誘導腫瘤細胞凋亡，因此CIK尤其適用于FasL陽性腫瘤的；

4.CIK細胞分泌的細胞因子能顯著刺激初始型T細胞增殖，有效激活機體的免疫系統，使之趨于正常，提高病人自身抗腫瘤的能力。

目前，腫瘤的發生機制尚未形成普遍接受的理論。研究者普遍認可腫瘤的發生、發展與人體的免疫功能密切相關。即在正常情況下，腫瘤與機體的防御機能之間處于一種動態的平衡，而一旦這種平衡被破壞，就可能發生腫瘤。身體各組織細胞受到外界化學、物理、生物等因素刺激或自身細胞衰老變異等因素的影響，使得體內某些細胞發生突變，成為癌前細胞；而機體免疫功能低下或者由于免疫異常，無法及時識別、殺傷、清除這些異常細胞，突變細胞在組織內復制生長，達到一定數量后破壞器官功能，腫瘤即發生。腫瘤患者，尤其是惡性腫瘤病人往往免疫功能、特別是細胞免疫功能低下，因而疾病呈進展、活動、預后差。因此，提高機體免疫力，建立有效的免疫應答是腫瘤最有希望的途徑。CIK細胞即將大量殺傷性高、功能強、數量多的免疫活性細胞回輸患者體內，直接發揮殺死腫瘤細胞的作用，并通過調節、激活患者的免疫體系，調動、提高患者自身的抗腫瘤能力。

CIK細胞具有以下突出的特點：

1.增殖速度快，殺瘤活性高。CIK細胞可以在體外大量擴增，培養14天可以增殖200倍以上，其效應細胞CD3+CD56+的增殖可達1000倍以上，抗腫瘤活性得以大大增強。

2.殺瘤譜廣。CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷是非MHC限制的，對多種腫瘤細胞均有殺滅作用。

3.能抵抗腫瘤細胞引發的效應細胞Fas-FasL凋亡。CIK細胞雖然在Fas被占據后會引起少量細胞凋亡，但對其殺瘤細胞毒性沒有明顯影響；反之，CIK細胞可以誘導FasL陽性腫瘤細胞的凋亡。

4.對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感。CIK細胞對放、化敏感的親本細胞和不敏感的轉化細胞均具有強大的殺傷活性。

5.CIK細胞殺瘤活性不受CsA（環孢霉素A）和FK506（普樂可復）等免疫抑制劑的影響。

6.對正常骨髓造血前體細胞毒性小，僅對紅系生成產生輕微的抑制，這可能與CIK細胞自身分泌高水平的IFN-γ有關。

7.CIK細胞具有識別腫瘤的機制，特異性強，對正常的細胞無毒性作用。

8.安全性好。CIK細胞是活化的患者自體細胞，應用安全，不會產生排斥等反應，患者副反應小。

產品特點:

1、 使用方便:不需昂貴設備。

2、 可以處理各種細菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

4、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。

5、 含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。

6、 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等。

8、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質，例如是否有雜細胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存，勿作多次解凍。使用的甘油也應為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6，依細胞種類而異。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。