1、準備工作

 

　　在開始任何實驗之前，仔細閱讀并理解所用熒光探針PCR試劑盒的說明書。不同品牌和類型的試劑盒可能有要求或優化條件。確保所有需要的試劑和設備都已準備好，包括但不限于模板DNA/RNA、引物、探針、酶混合物、緩沖液以及所需的耗材如PCR管或板。此外，檢查所有儀器是否正常工作，比如熱循環儀應經過校準以保證溫度控制的準確性。

 

　　2、樣本處理與質量控制

 

　　高質量的樣本是獲得可靠結果的基礎。對于RNA樣品，建議先進行DNase處理以去除潛在的基因組DNA污染；而對于DNA樣品，則需評估其純度和濃度，通常通過紫外分光光度計測量A260/A280比值來確定。理想的比值應在1.8至2.0之間。同時，對樣本進行適當的稀釋，確保PCR反應體系中的核酸量處于推薦范圍內。

 

　　3、試劑配制與加樣

 

　　按照說明書指示，準確配制PCR反應混合物。這通常涉及將酶、緩沖液、dNTPs、引物和探針等成分按比例混合。注意避免反復凍融酶制劑，并盡量減少操作時間以防酶活性喪失。使用無菌技術小心地向每個PCR管或孔中加入適量的反應混合物和樣本，確保無氣泡產生且各孔間無交叉污染。使用帶濾芯的移液器吸頭可有效防止這種污染。

 

　　4、運行PCR與數據分析

 

　　設置好熱循環儀的程序參數，包括變性、退火和延伸溫度及時長，具體數值依據所用引物和目標序列特性調整。啟動PCR后，實時監控熒光信號變化，記錄Ct值（閾值循環數）。Ct值反映了目標序列在反應中被檢測到的時間點，較低的Ct值表示較高的起始拷貝數。完成PCR后，利用配套軟件分析數據，繪制標準曲線計算未知樣本中的目標序列濃度。